ТОВ "БІОТЕХ"
Ронколейкін® – рекомбінантний інтерлейкін-2 людини: фармакологія та біологічна активність

Посібник для лікарів
З.К. Ніколаєва, В.М. Єгорова, В.К. Козлова
2002

Вступ

Використання засобів імуноорієнтованої терапії є особливістю сучасної практичної медицини. Лікування багатьох захворювань без застосування цих засобів неможливе, і вони входять як обов'язкова складова в комплексну терапію. При цьому ефективність медикаментозної корекції дисфункцій імунореактивності залежить від природи імуномодулятора, що використовується, і специфічності його впливу.

Спектр лікарських засобів, що мають імунотропну активність, досить широкий і різноманітний. Сьогодні у клінічній практиці все більшого поширення набувають рекомбінантні (генноінженерні) препарати, які відтворюють основні властивості природних (ендогенних) цитокінів та є ефективними імунокоректорами [19, 38, 44, 50].

Структура, біологічна активність та механізми дії більшості ендогенних цитокінів досить повно охарактеризовані, що дозволяє отримувати їх рекомбінантні аналоги методами сучасної біотехнології у достатніх для клінічного використання кількостях та цілеспрямовано здійснювати імунокорекцію.

На етапі розвитку фармакології цитокинам як лікарським препаратам з метою імунотерапії відводиться особлива роль. Цитокінові препарати, заповнюючи дефіцит ендогенних регуляторних та ефекторних молекул імунної системи, мають замісні та універсальні індуктивні ефекти, а їх імунотропна активність багатофакторна і не вимагає для своєї реалізації значного часу. Крім того, більшість цитокінових препаратів не має протипоказань для використання, що дозволяє застосовувати їх у дозах, які значно перевищують фізіологічні. Метаболізм пікових концентрацій реалізується природними шляхами обміну ендогенних біомолекул, що різко зменшує ймовірність прояву побічних ефектів. При цьому цільові ефекторні клітини активізуються навіть за умов стійких імунодефіцитних станів. Це особливо актуально при тяжкій інфекційній патології та онкологічних захворюваннях [16, 18, 20, 59, 66].

Препарат Ронколейкін® – рекомбінантний інтерлейкін-2 – є одним із представників сімейства лікарських засобів, що використовуються при проведенні цитокінотерапії. Ронколейкін® має імунокоригуючу дію, спрямовану на посилення протибактеріального, противірусного, протигрибкового та протипухлинного імунітету [24, 26].

Природний інтерлейкін-2 людини – це одноланцюговий глікопротеїн з молекулярною масою від 15 000 до 18 000 Да, що визначається ступенем глікозилювання. Людина IL-2 є продуктом гена, розташованого в 4-й хромосомі. IL-2 людини синтезується як попередник із 153 амінокислотних залишків, де перші 20 амінокислот є секреторною сигнальною послідовністю. Цей попередник процесується в зрілий білок, що має первинну структуру з 133 амінокислотних залишків і молекулярну масу 15420 Так [86, 90]. У поліпептидному ланцюгу IL-2 є три цистеїнові залишки в положеннях 58, 105 і 125 (Cys58, Cys105 і Cys125 відповідно), внаслідок чого він здатний до утворення різних внутрішньо-і міжмолекулярних дисульфідних зв'язків. Найбільшу біологічну активність має молекула IL-2, що має дисульфідний зв'язок Cys58/Cys105 і вільну сульфгідрильну групу в положенні 125 [11, 21, 72, 83-84, 86, 90]. Істотною особливістю IL-2 є його гідрофобність, що найбільш характерно для відновленої форми молекули, що містить повний набір сульфгідрильних груп.

Ронколейкін®: склад препарату

Ронколейкін® сухий для ін'єкцій (Roncoleukin®, реєстраційне посвідчення № 000122/01-2000) - лікарська форма рекомбінантного інтерлейкіну-2 людини (rIL-2), виділеного та очищеного з клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae 2 [55, 65]. Ронколейкін® містить в якості активного початку рекомбінантний інтерлейкін-2 (rIL-2), а також солюбілізатор - додецилсульфат натрію (ДСН), стабілізатор – D-маніт, відновник – дитіотреітол (ДТТ) та компоненти аммоній-гідрокарбонатного буфера [54] (Табл. 1).

Таблиця1.

Складові Ронколейкіна®

Ронколейкін® випускають у сухому вигляді в ампулах у дозах по 1 мг (1 000 000 ME), 0,5 мг (500 000 ME), 0,25 мг (250 000 МО) діючого початку rIL-2.

Рекомбінантний інтерлейкін-2  (rIL-2)

- Білок з молекулярною масою 15300 ± 200 Да. rIL-2 людини - структурний та функціональний аналог ендогенного IL-2.

Інформація про властивості та структуру молекули рекомбінантного IL-2 отримані з використанням наступних методів: електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію, оцінки імунологічної ідентичності, аналізу амінокислотної послідовності молекули rIL-2 та визначення специфічної біологічної активності клітин CTLL-2 [54, 65].

За допомогою методу електрофорезу у поліакриламідному гелі (ПААГ-ЕФ) у присутності додецилсульфату натрію (ДСН) можна оцінити рухливість білкових молекул у полі постійного електричного струму. Кожна молекула білка пов'язує значну кількість негативно заряджених молекул ДСН, загальний заряд яких перевищує загальний заряд білка. Тому білок після того, як буде додана напруга, почне рухатися в напрямку позитивного електрода. У порах поліакриламідного гелю, що діє як молекулярне сито, великі білки гальмуються значно швидше ніж малі. Внаслідок цього складна суміш білків ділиться на ряд смуг, розташованих відповідно до їх молекулярної маси. Забарвивши гель барвником кумасі синім, можна виділити основні фракції поліпептидів. Порівняння розташування смуг аналізованих поліпептидів та маркерів відомих молекулярних мас, а також визначення розміру забарвленої смуги дозволяє охарактеризувати якісний та кількісний склад препарату.

Розмір основної смуги, що спостерігається після проведення ПААГ-ЕФ, відповідає 15300 Да, його вміст у препараті коливається від 75% до 80%. Виділений білок 15 300 Да показує повну імунологічну ідентичність у тесті з моноклональними антитілами до IL-2 людини і має специфічну біологічну активність у тесті з IL-2 залежною лінією клітин CTLL-2.

Антитіла (АТ) були виготовлені на замовлення в НДІ гематології та переливання крові (м. Мінськ, Білорусія). Для отримання АТ був використаний секреторний рекомбінантний ІЛ-2 в окисленій та глікозильованій формі, отриманий в лаб. біохімічної генетики СПбГУ.

Аналіз амінокислотної послідовності N-кінцевого фрагмента даного білка та пептидного складу триптичного гідролізату, одержуваного після перетравлення білка 15300 Так трипсином, також підтверджує його ідентичність з ендогенним IL-2.

При електрофорезі, крім основної смуги, є додаткова смуга, що відповідає низькомолекулярному білку 13 000 Да, вміст якої в препараті становить 15-20 %. Визначення амінокислотної послідовності N-кінцевого фрагмента білка 13 000 Так показало, що він є укороченим варіантом білка 15 300 Так, що починається з 23 амінокислоти. «Інтерлейкінова природа» білка 13 000 Да підтверджується тим, що він специфічно взаємодіє з тими ж моноклональними антитілами, отриманими до IL-2 з молекулярною масою 15 300 Да, і також має специфічну біологічну активність у тесті з IL-2 зависимой 2.

Обидва білки виділяються тільки з дріжджового екстракту штаму, трансформованого плазмідою з геном IL-2 людини, у дріжджовому екстракті контрольного штаму-реципієнта обидва білки відсутні.

У зв'язку з тим, що білок 13 000 Так має меншу питому активність і знижену стійкість при зберіганні в розчині, при формулюванні та позначенні кількості rIL-2 в ампулі враховують тільки кількість rIL-2 з молекулярною масою 15 300 Да.

У препараті припустимий також незначний вміст димерів зазначених вище двох білків (не більше 2%).

Чистоту препарату Ронколейкін® визначають за сумарним вмістом білків «інтерлейкінової природи», що має становити не менше 93%.

Крім білків «інтерлейкінової природи» у препараті допускається присутність домішкових (дрожжових) білків, що у сумі має перевищувати 5%.

Додецилсульфат натрію (ДСН) – солюбілізатор rIL-2

rIL-2, експресований дріжджами, не глікозильований, повністю позбавлений дисульфідних зв'язків і не активний. Внаслідок гідрофобності відновленої форми молекули rIL-2 повністю не розчинний. Для його солюбилізації використовують буфери з великим вмістом ДСН (2-5%), здатного впливати у високих концентраціях (вище 0,1%) як на третинну, а й у вторинну структуру білка [71]. ДСН, зв'язуючись із гідрофобними ділянками білкових молекул, викликає їх розгортання у довгі витягнуті ланцюги, які добре солюбілізуються у розчині ДСН. Крім того, буферні розчини в якості відновлюючого агента додають 2-меркаптоэтанол (2-МЕ), що руйнує в білках дисульфідні зв'язки.

Присутність у буферних розчинах всіх стадіях очищення ДСН і 2-МЕ дозволяє зберегти білок як розчинного, повністю відновленого неактивного мономеру. У формулюваному препараті на 1 мг rIL-2 припадає 10 мг ДСН. Доза ДСН, що вводиться з препаратом, в 1500 разів нижче токсичної.

Інші рекомбінантні препарати, наприклад Альдеслейкін [80, 88], представлені окисленою формою rIL-2, яка характеризується меншою гідрофобністю. Однак для підвищення його розчинності ін'єкційні лікарські композиції також додають ДСН. Добавка ДСН до окисленого rIL-2 у Пролейкіні становить 0,20-0,23 мг на 1 мг білка.

Дітіотреітол (ДТТ) – відновник для rIL-2

Дітіотреітол застосовується для того, щоб захистити SH-групи rIL-2 від неконтрольованого окислення в період формулювання, стерилізації та розливу, коли відбувається заміна буфера з 2-МЕ на формулюючий. ДТТ запобігає утворенню неправильних внутрішньомолекулярних та міжмолекулярних -S-S- зв'язків, що призводять до формування димерів та полімерів, біологічна активність яких значно нижча, ніж у мономерних молекул. Дітіотреітол широко використовується для відновлення дисульфідних груп білків.

ДТТ присутній у препараті як компонент буфера в концентрації, що не перевищує 0,08 мг на ампулу, незалежно від вмісту в ній rIL-2, що у 70 000 разів нижче за токсичну.

D-маніт – стабілізатор для rIL-2

D-маніт використовується для формування таблетки. У препараті на 1 мг rIL-2 припадає 50 мг D-маніту.

Біологічна активність rIL-2

є основним критерієм його відповідності до ендогенного IL-2 людини. При титруванні активності IL-2 визначають його здатність підтримувати проліферацію IL-2 залежної лінії цитотоксичних лімфоцитів миші або лімфоцитів периферичної крові донорів [74-75, 76-77, 82, 85, 89-90]. Оцінку біологічної активності Ронколейкіна® проводять у міжнародному стандартному тесті з культурою IL-2-залежних пухлиноспецифічних цитотоксичних Т-лімфоцитів миші лінії CTLL-2 [65]. Біологічно активний rIL-2 має стимулювати проліферацію цих клітин. Визначення біологічної активності проводять з використанням колориметричного методу з тетразолієвим барвником МТТ. Життєздатні клітини, стимульовані IL-2 (rIL-2), поглинають барвник та накопичують у цитоплазмі нерозчинні у воді темно-сині кристали формазану (відновлений МТТ). Після видалення культурального середовища та повного розчинення кристалів у диметилсульфоксиді вимірюють оптичну щільність отриманого розчину на комп'ютеризованому фотометрі при довжині хвилі 540 та 690 нм. Темно-синє фарбування розчину в пробах, що містять rIL-2, повинне бути залежним від концентрації rIL-2, внесеного в культуральне середовище. Криві, що відображають залежність виміряних значень оптичної щільності в лунках від кількості внесеного до них rIL-2 (стандартного зразка або аналізованого препарату), мають сигмоїдну (S-подібну) форму. Прямолінійна ділянка кривих, на якій оптична щільність пропорційна кількості rIL-2 в пробі, розташовується в межах від 0,2 до 50 ME. За величиною оптичної густини визначають вміст IL-2 (rIL-2) в інкубаційній пробі. Відповідно до колориметричного методу за міжнародну одиницю активності (МЕ) rIL-2 приймається така його кількість, при якому оптична щільність розчину, одержуваного при розчиненні кристалів формазану, відповідає 50% від максимального рівня забарвлення. Активність, віднесена до одиниці маси (МЕ/мг), називається питомою активністю. Визначення біологічної активності передбачає використання відповідних контролів [65].

Позитивний контрольний зразок (ПКО) – розчин IL-2 людини, еталонного реагенту Програми модифікаторів біологічних реакцій (з Національного інституту раку, США) або відкалібрований за цим еталонним реагентом лабораторний зразок rIL-2, що зберігається при мінус 700С і який розморожується один раз для використання тільки під час одного визначення.

Негативний контрольний зразок (НКО) - середовище RPMI 1640 для культивування клітин CTLL-2, що містить суміш допоміжних речовин, що входять до складу Ронколейкіна: D-маніт, ДСН, NH4HCO3 в концентраціях, відповідних їх вмісту в випробуваному зразку. Оптична щільність НКО віднімається з оптичної щільності ПКО.

ПКО та випробуваний зразок розбавляють таким чином, що виходить близько 10 інкубаційних проб, активність яких знаходиться в області від 100 до 0,2 МО/мл. Молекула rIL-2 стає біологічно активною лише після досягнення певної третинної структури, при цьому у фізіологічних умовах rIL-2 спонтанно приймає нативну конформацію.

Утворенню нативної структури rIL-2 та її окисленню сприяє зниження концентрації детергенту (ДСН) [71]. Повне його усунення не бажано, оскільки він необхідний розчинення білка.

Вплив ДТТ на активність rIL-2 не суттєвий: незначна його кількість в ампулі (5-10 мкг/мл) швидко окислюється киснем повітря і не перешкоджає конформаційним перетворенням rIL-2.

Вихід окисленого мономеру значно зростає при зниженні концентрації rIL-2 у розчині до 1 мкг/мл, при цьому одночасно знижується ймовірність утворення димерів та полімерів rIL-2. Слід зауважити, що саме така концентрація досягається в процесі розчинення Ронколейкіна в 400 мл 0,9% NaCl (об'єм крапельниці) при підготовці розчину для внутрішньовенного введення препарату.

Для окислення rIL-2 також необхідний кисень та сліди каталізатора – іонів міді (Cu++).

Відновлена та окислена форми rIL-2 людини, отримані з Е. сoli, суттєво різняться за своєю активністю. Відновлена форма rIL-2 має значно нижчу питому активність – 2 400 000 МО/мг [74], окислені форми rIL-2 , експресовані в Е. сoli, (Альдеслейкін, а також rIL-2 фірми Hoffmann LaRoche) характеризуються більш високою біологічною активністю [79, 85, 87].

Питома активність rIL-2 має найбільше значення для клініцистів, оскільки її величина визначає дози, які рекомендуються при використанні Ронколейкіна®. У свою чергу значення питомої активності залежить від методики її визначення. Зокрема, її величину впливає склад розчинника для rIL-2: 0,1 % ДСН чи 0,9 % розчин NaCl (фізіологічний розчин), що містить сироватковий альбумін людини (ЧСА).

Чим нижче концентрація ДСН, тим більше структура rIL-2 наближається до структури нативного білка, тим вища його питома активність.

При розчиненні сухого Ронколейкіну в 0,1% ДСН з подальшим титруванням середовищем для росту клітин CTLL-2 (RPMI 1640) питома активність Ронколейкіна становить (1 200 000 ± 400 000) МО/мг.

При розчиненні вмісту ампули Ронколейкіна в 400 мл 0,9% NaCl (об'єм крапельниці) з додаванням 0,15% ЧСА питома активність Ронколейкіну зростає в 10 разів і стає рівною 12 000 000 МО/мг (табл. 2).

Дані про зростання активності rIL-2 при розчиненні сухого Ронколейкіна у фізіологічному розчині з ЧСА збігаються з результатами досліджень, проведених у НДІ клінічної імунології СО РАМН (м. Новосибірськ). Біологічну активність rIL-2 Ронколейкіна® та референс-зразка IL-2 визначали за їх здатністю посилювати проліферацію бластних клітин крові донорів, стимульованих фітогемагглютиніном. Показано, що найбільш оптимальною умовою для прояву активності rIL-2 у препараті є розведення Ронколейкіну в забуференому фізіологічному розчині з додаванням 0,1% ЧСА. У цьому випадку спостерігається 10-кратне збільшення активності rIL-2 по відношенню до препарату, розведеного в 0,1% ДСН (табл. 2).

Таблиця 2.

Співвідношення біологічної активності окисленої та відновленої форм rIL-2

Вивченню процесів окислення та відновлення rIL-2 присвячено низку робіт [71, 81, 91-94]. Дослідники, що працювали з рекомбінантними інтерлейкінами-2, відзначають, що критичними для прояву біологічної активності rIL-2 є такі структурні особливості молекули: наявність дисульфідного містка між цистеїнами Cys58/Cys105 і наявність амінокислотних залишків Leu17 (лейцин в положенні положенні 121). Придбання молекулою rIL-2 третинної структури, що супроводжується утворенням дисульфідного містка Cys58/Cys105, призводить до переходу rIL-2 з відновленої форми в окислену.

У той же час активність rIL-2 не залежить від того, з якої амінокислоти починається поліпептид [92], а також від наявності цистеїну в положенні 125 (Cys125) або його заміни на інші амінокислоти: серин (Ser125), аланін (Ala125) або аспарагін (Asp125) [71].

В даний час найбільш відомими аналогами Ронколейкіна® є два комерційні препарати на основі rIL-2, експресованого кишковою паличкою (Е. сoli): Пролейкін (Альдеслейкін) виробляється в США (фірма Cetus) та Європі (фірма Chiron), і rIL-2 фірми Hoffmann LaRoche(HLR) виробляється у Франції.

Пролейкін (Альдеслейкін), незважаючи на відсутність N-термінального аланіну (Ala1) і заміну цистеїну в положенні 125 (Cys125) на серин (Ser125), має аналогічну з нативним IL-2 питомою біологічною активністю - 16 000 000 0.

rIL-2 фірми Hoffmann LaRoche(HLR) відрізняється від нативного ІЛ-2 наявністю метіоніну на N кінці молекули. Його питома активність становить 12 000 000-15 000 000 МО/мг.

Зазначені препарати містять окислену форму rIL-2, мають однакову молекулярну масу, однакову фармакокінетику, не глікозильовані.

Зроблено спробу порівняти in vivo та in vitro ці два препарати [78]. Показано кількісні відмінності щодо активності та відповідно ефективності дії зазначених лікарських засобів. При використанні однакової дози 1500000 МО знайдено, що rIL-2, що входить до складу препарату фірми HLR, індукував звільнення в сироватку крові більшої кількості розчинного a-рецептора IL-2, ніж rIL-2 фірми Chiron. З використанням методу проточної цитометрії також було виявлено кількісні відмінності у здатності цих двох рекомбінантних інтерлейкінів-2 зв'язуватися з рецепторами IL-2. Отримані результати вказують на суттєві відмінності у біологічній активності цих препаратів: ефективність rIL-2 (HLR) приблизно в чотири рази вища, ніж rIL-2 (Chiron). Клінічне використання зазначених препаратів показало, що поряд із більшою активністю in vivo rIL-2 (HLR) виявляє і більшу токсичність.

Клінічний досвід демонструє більш високу токсичність бактеріальних препаратів порівняно з дріжджовим Ронколейкіном. Гарячка, нудота, блювання, печінкова токсичність, що спостерігаються при їх введенні, не виявляються при використанні Ронколейкіна®, інфузії якого можуть супроводжуватися лише короткочасним підвищенням температури. Ронколейкін® практично не має побічних ефектів на відміну від Пролейкіна і легко переноситься пацієнтами. Дози, рекомендовані при використанні Ронколейкіна® встановлені на підставі клінічного досвіду його успішного та ефективного застосування для лікування онкологічних, гнійно-септичних та інфекційних захворювань та з профілактичною метою.

Ронколейкін® використовують:

• з метою імунопротекції – у дозі 250 000 МО (0,25 мг), що відповідає біологічній активності 3 000 000 МО окисленої форми rIL-2;

• з метою імунокорекції - у дозі 500 000 МО (0,5 мг), що відповідає біологічній активності 6 000 000 МО окисленої форми rIL-2;

• з метою імунореставрації – у дозі 1 000 000 МО (1,0 мг), що відповідає біологічній активності 12 000 000 МО окисленої форми rIL-2 [24, 26].

Семирічний досвід застосування Ронколейкіна® в схемах лікування сепсису, гнійно-запальних захворювань 69, 73], інфекційної патології [3, 5-6, 12-13, 17, 22-23, 30, 35-37, 43, 49, 53, 56, 61-63, 70], злоякісних пухлин [1, 7, 10, 29, 34, 40-42, 52] - свідчення його ефективності та безпеки.